Revertaas on ensüüm, mis sünteesib RNA matriitsil cDNA-d.

Mõnede viiruste genoom ei ole DNA, nagu tavaliselt, vaid RNA. Selliseid viirusi nimetati retroviirusteks (retro - vastupidine). 1970. aastal avastasid D. Baltimore ja Kh.M Temin viiruse RNA-lt DNA-le edastamise mehhanismi, st. vastupidine kõrgemate organismide rakkudes toimuvale. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks ja seda teostavat ensüümi nimetatakse pöördtranskriptaasiks või revertaasiks.

Pöördtranskriptaas ehk pöördtranskriptaas [lat. transkriptio- ümberkirjutamine) - ensüüm RNA-sõltuv DNA polümeraas, mille abil viiakse läbi pöördtranskriptsioon - DNA süntees RNA maatriksil; mida kodeerivad mõnede RNA viiruste genoomid ja kõrgemate organismide genoomi liikuvad geneetilised elemendid, mis on geenitehnoloogia oluline "tööriist". Pöördtranskriptaasil on vähemalt kolm ensümaatilist aktiivsust:

1) DNA polümeraas, mis kasutab matriitsina nii RNA-d kui ka DNA-d;

2) RNaasi H aktiivsus, mis hüdrolüüsib RNA-d osana RNA-DNA hübriidist, kuid mitte ühe- või kaheahelalist RNA-d ja

3) DNA endonukleaasi aktiivsus.

Avastasid iseseisvalt D. Baltimore ja H. Temin 1970. aastal RNA-d sisaldavates kasvajaviirustes (1975. aasta Nobeli preemia koos R. Dulbeccoga).

Seega on pöördtranskriptaasid võimelised sünteesima DNA-d RNA matriitsil, polümeriseerides neli desoksüribonukleosiidtrifosfaati. Ja nagu DNA polümeraasid, toimivad nad ainult praimeri juuresolekul.

Pöördtranskriptaase kasutatakse RNA-ga (eriti mRNA-ga) komplementaarse kaheahelalise DNA sünteesil selle järgnevaks kloonimiseks plasmiidvektoritesse, kui saadakse cDNA raamatukogusid (klonoteksid). Pöördtranskriptaase, nagu DNA polümeraase, saab kasutada radioaktiivse või fluorestseeruva märgise sisestamiseks DNA sondidesse sobivalt märgistatud desoksüribonukleosiidtrifosfaatides.

Võime sünteesida DNA-d RNA matriitsil teatud tingimustel on tõestatud Thermus thermophilus'e termostabiilse DNA polümeraasi puhul. See võimaldab seda kasutada spetsiifiliste RNA-de otseseks tuvastamiseks bioloogilistes proovides PCR abil. Selle lähenemisviisi kaasaegsed modifikatsioonid võimaldavad ühes reaktsioonisegus (ja katseklaasis) sünteesida pöördtranskriptsioonireaktsioonis RNA matriitsil oleva amplifitseeritud DNA fragmendi väikese arvu koopiaid, mida kasutab kohe sama ensüüm nagu matriitsi tavapärases PCR-is (ühe toru PCR).

Pöördtranskriptaas (pöörd- või RNA-sõltuv DNA polümeraas) on ensüüm, mis katalüüsib DNA sünteesi RNA matriitsil protsessis, mida nimetatakse " pöördtranskriptsioon". Protsessi nimi peegeldab protsessi vastupidist transkriptsioonid, viiakse läbi teises suunas: DNA matriitsi molekulist sünteesitakse RNA transkript.

Need ensüümid eraldati RNA viirustest ( retroviirused). Kasvajaviirused kasutavad pöördtranskriptaasi mRNA transkribeerimiseks DNA komplementaarseks ahelaks. Uurides retroviirusi, mille genoomi esindavad üheahelalised RNA molekulid, avastati, et intratsellulaarse arengu protsessis läbib retroviirus oma genoomi integreerimise etapi kaheahelalise DNA kujul kromosoomidesse. peremeesrakust. 1964. aastal püstitas Temin viirusespetsiifilise ensüümi olemasolu, mis on võimeline sünteesima RNA matriitsil komplementaarset DNA-d. Sellise ensüümi eraldamiseks tehtud jõupingutusi kroonis edu ning 1970. aastal avastasid Temin ja Mizutani, aga ka iseseisvalt Baltimore soovitud ensüümi Rousi sarkoomiviiruse rakuväliste virionide preparaadis. Seda RNA-sõltuvat DNA polümeraasi nimetatakse pöördtranskriptaasiks või revertaasiks.

Kõige üksikasjalikumalt on uuritud lindude retroviiruste revertaasi. Iga virion sisaldab umbes 50 selle ensüümi molekuli. Pöördtranskriptaas koosneb kahest subühikust - a (65 kDa) ja b (95 kDa), mis esinevad ekvimolaarsetes kogustes. Pöördtranskriptaasil on vähemalt kolm ensümaatilist aktiivsust:

1) DNA polümeraas, mis kasutab matriitsina nii RNA-d kui ka DNA-d;

2) RNaas H aktiivsus, mis hüdrolüüsib RNA-d RNA-DNA hübriidi osana;

3) DNA endonukleaasi aktiivsus.

Esimesed kaks tegevust on vajalikud viiruse DNA sünteesiks ja endonukleaas näib olevat oluline viiruse DNA integreerimiseks peremeesraku genoomi. Puhastatud pöördtranskriptaas sünteesib DNA nii RNA kui ka DNA matriitsidel (joonis 11).

Riis. 11. RNA molekulide kaheahelaliste DNA koopiate sünteesi skeem

Sünteesi alustamiseks vajab reversetaas, nagu ka teised polümeraasid, lühikest kaheahelalist piirkonda (praimerit). Praimer võib olla nii RNA kui ka DNA üheahelaline segment, mis reaktsiooni käigus seotakse kovalentselt äsja sünteesitud DNA ahelaga. Geenitehnoloogias kasutatakse mõlemat oligo-(dT) praimerit, mis on komplementaarsed mRNA 3"-polüA otstega, ja heksanukleotiidide komplekti "juhusliku" koostise ja järjestusega (juhuslikud praimerid). Sageli RNA molekulide jaoks, millel on teadaolev primaarne järjestuses, millel ei ole 3"-polü(A) otsad, kasutatakse keemiliselt sünteesitud oligonukleotiide, mis on komplementaarsed 3" otsaga

Pöördtranskriptaasi kasutatakse peamiselt messenger-RNA transkribeerimiseks komplementaarseks DNA-ks (cDNA). Pöördtranskriptsiooni reaktsioon viiakse läbi spetsiaalselt valitud tingimustes, kasutades tugevaid RNaasi aktiivsuse inhibiitoreid. Sel juhul on võimalik saada sihtmärk-RNA molekulide täispikki DNA koopiaid. Pärast komplementaarse DNA ahela sünteesi mRNA-l ja RNA hävitamist (tavaliselt kasutatakse leelistöötlust), viiakse läbi teise DNA ahela süntees. Sel juhul kasutatakse reversetaasi võimet moodustada üheahelaliste cDNA-de 3-tollistes otstes isekomplementaarseid juuksenõelu, mis võivad toimida praimerina.

Matriitsiks on cDNA esimene ahel. Seda reaktsiooni saab katalüüsida kas E. coli pöörd- või DNA polümeraas I abil. On näidatud, et nende kahe ensüümi kombinatsioon võimaldab suurendada täielike kaheahelaliste cDNA molekulide saagist. Sünteesi lõpus jäävad esimene ja teine ​​cDNA ahel kovalentselt seotuks juuksenõela ahelaga, mis toimis teise ahela sünteesi ajal praimerina. Seda silmust lõikab endonukleaas S1, mis hävitab spetsiifiliselt üheahelalisi piirkondi nukleiinhapped. Sel juhul moodustunud otsad ei ole alati tömbid ja järgneva kloonimise tõhususe suurendamiseks parandatakse need tömbiks, kasutades E. coli DNA polümeraasi I Klenowi fragmenti. Saadud kaheahelalise cDNA saab seejärel sisestada kloonimisvektoritesse, paljundada osana hübriid-DNA molekulidest ja kasutada edasistes uuringutes.

Uurides retroviirusi, mille genoomi esindavad üheahelalised RNA molekulid, avastati, et rakusisese arengu käigus läbivad nad oma genoomi integreerimise etapi kaheahelalise DNA kujul peremeesraku kromosoomidesse. 1964. aastal oletas X. Temin viirusspetsiifilise ensüümi olemasolu, mis on võimeline sünteesima komplementaarset DNA-d RNA matriitsil. 1970. aastal avastasid X. Temin ja S. Mizutani, aga ka neist sõltumatult D. Baltimore sellise ensüümi Rousi sarkoomiviiruse rakuväliste virionide preparaadis. Seda RNA-sõltuvat DNA polümeraasi nimetatakse revertaasiks (pöördtranskriptaasiks).

Kõige üksikasjalikumalt on uuritud lindude retroviiruste revertaasi. Iga virion sisaldab umbes 50 selle ensüümi molekuli. Pöördtranskriptaas koosneb kahest subühikust - ά (65 kDa) ja β (95 kDa), mis esinevad ekvimolaarsetes kogustes. ά-subühik on β-subühiku N-terminaalne osa (kaks kolmandikku).

Pöördtranskriptaasil on vähemalt kolm ensümaatilist aktiivsust:

· DNA polümeraas, mis kasutab mallina nii RNA-d kui ka DNA-d;

· RNaasi H aktiivsus, mis hüdrolüüsib RNA-d osana RNA-DNA hübriidist, kuid mitte ühe- või kaheahelalist RNA-d;

· DNA endonukleaas.

Esimesed kaks tegevust on vajalikud viiruse DNA sünteesiks ja endonukleaas näib olevat oluline viiruse DNA integreerimiseks peremeesraku genoomi. Revertaasi β-subühikul on kõik kolm aktiivsust, samas kui ά-subühikul on ainult polümeraas ja RNaas H.

Puhastatud pöördtranskriptaas sünteesib DNA nii RNA kui ka DNA matriitsidest. Sünteesi alustamiseks vajab reversetaas, nagu ka teised polümeraasid, lühikest kaheahelalist piirkonda – praimerit. Praimer võib olla nii RNA kui ka DNA üheahelaline segment, mis reaktsiooni käigus seotakse kovalentselt äsja sünteesitud DNA ahelaga.

Pöördtranskriptaasi kasutatakse peamiselt messenger-RNA transkribeerimiseks komplementaarseks DNA-ks (cDNA). Pöördtranskriptsiooni reaktsioon viiakse läbi tugevate RNaasi aktiivsuse inhibiitorite juuresolekul. Sel juhul on võimalik saada sihtmärk-RNA molekulide täispikki DNA koopiaid. Oligo(dT) kasutatakse praimerina polü(A) sisaldavate mRNA-de pöördtranskriptsiooniks (joonis fig.) ja RNA molekulide jaoks, millel ei ole 3" polü(A) otsa, kasutatakse keemiliselt sünteesitud oligonukleotiide, mis on komplementaarsed 3" otsaga. uuritav RNA. Lisaks saab viimast tüüpi RNA molekule E. coli polü(A) polümeraasi kasutades muundada polü(A)-sisaldavateks.

Pärast komplementaarse DNA ahela sünteesi mRNA-l ja RNA hävitamist (tavaliselt kasutatakse leelistöötlust), viiakse läbi teise DNA ahela süntees. Sel juhul kasutatakse reversease võimet moodustada üheahelaliste cDNA-de 3" otstesse isekomplementaarseid juuksenõelu, mis võivad toimida praimerina. Matriits on cDNA esimene ahel. Seda reaktsiooni saab katalüüsida nii reversease kui ka E. coli DNA polümeraas I. Nende kahe ensüümi kombinatsioon võimaldab suurendada täielike kaheahelaliste cDNA molekulide saagist.

Sünteesi lõpus jäävad esimene ja teine ​​cDNA ahel kovalentselt seotuks juuksenõela ahelaga, mis toimis teise ahela sünteesi ajal praimerina. Seda silmust lõikab endonukleaas S1, mis hävitab spetsiifiliselt nukleiinhapete üheahelalisi sektsioone. Sel juhul moodustunud otsad ei ole alati tömbid ja järgneva kloonimise tõhususe suurendamiseks parandatakse need tömbiks, kasutades E. coli DNA polümeraasi I Klenowi fragmenti. Saadud kaheahelalise cDNA saab seejärel sisestada kloonimisvektoritesse, paljundada osana hübriid-DNA molekulidest ja kasutada edasistes uuringutes.

Seda nimetatakse nii, kuna enamik transkriptsiooniprotsesse elusorganismides toimub teises suunas, nimelt sünteesitakse RNA transkriptsioon DNA molekulist.

Lugu

Pöördtranskriptaasi avastas Howard Temin Wisconsini-Madisoni ülikoolis ja sõltumatult David Baltimore 1970. aastal. Mõlemad teadlased said 1975. aastal koos Renato Dulbeccoga Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinna.

Transkriptsiooni täpsus

RNA-lt DNA-ks pöördtranskriptsiooniga kaasneb kõrgel tasemel translatsioonivead, eristab see pöördtranskriptaasi teistest DNA polümeraasidest. Need vead võivad põhjustada mutatsioone, mis põhjustavad viiruste ravimiresistentsust.

Tähtsus viiruste jaoks

Pöördtranskriptsioon on vajalik eelkõige retroviiruste, näiteks inimese immuunpuudulikkuse viiruse ja inimese T-rakulise lümfoomi tüüpi 1 ja 2 elutsükli jaoks. Pärast viiruse RNA sisenemist rakku sünteesib viirusosakestes sisalduv pöördtranskriptaas sellega komplementaarse DNA ja seejärel lõpetab sellel DNA ahelal, nagu maatriksil, teise ahela.

Tähendus eukarüootidele

Rakendus

Retroviirusevastane ravi

Roll geenitehnoloogias

Geenitehnoloogias kasutatakse pöördtranskriptaasi cDNA tootmiseks, mis on eukarüootse geeni koopia, mis ei sisalda introneid. Selleks eraldatakse kehast küps mRNA (kodeerib vastavat geeniprodukti: valku, RNA-d) ja sellega matriitsina teostatakse pöördtranskriptsioon. Saadud cDNA saab transgeense produkti saamiseks transformeerida bakterirakkudesse.

Vaata ka

Kirjutage ülevaade artiklist "Pöördtranskriptaas"

Märkmed

Pöördtranskriptaasi iseloomustav väljavõte

Keiser Franz vaatas väljasõidul ainult pingsalt Austria ohvitseride vahel määratud kohas seisva prints Andrei näkku ja noogutas talle pika peaga. Kuid pärast eilsest tiivast lahkumist andis adjutant Bolkonskyle viisakalt edasi keisri soovi talle publikut anda.
Keiser Franz võttis ta vastu, seistes keset tuba. Enne vestluse alustamist tabas prints Andrei tõsiasi, et keiser näis olevat segaduses, ei teadnud, mida öelda, ja punastas.
– Ütle mulle, millal lahing algas? — küsis ta kähku.
Prints Andrei vastas. Sellele küsimusele järgnesid teised, sama lihtsad küsimused: “Kas Kutuzov on terve? Kui kaua ta Kremsist lahkus?" jne. Keiser rääkis sellise näoilmega, nagu oleks kogu tema eesmärk vaid teatud arv küsimusi esitada. Vastused neile küsimustele, nagu oli liigagi ilmne, ei suutnud teda huvitada.
– Mis ajal lahing algas? - küsis keiser.
"Ma ei oska öelda teie Majesteedile, mis kell lahing rindelt algas, kuid Dürensteinis, kus ma olin, alustas armee rünnakut kell 6 õhtul," ütles Bolkonsky elavnedes ja samal ajal. eeldades, et ta suudab oma peas juba valmisolevat esitada tõepärase kirjelduse kõigest, mida ta teadis ja nägi.
Kuid keiser naeratas ja katkestas ta:
- Mitu miili?
- Kust ja kuhu, Teie Majesteet?
– Durensteinist Kremsi?
- Kolm ja pool miili, Teie Majesteet.
-Kas prantslased on vasakult kaldalt lahkunud?
«Nagu spioonid teatasid, läksid viimased tol ööl parvedele.
– Kas Kremsis on piisavalt sööta?
– Sööta ei tarnitud sellises koguses...
Keiser katkestas ta.
– Mis ajal kindral Schmit tapeti?
- Kell seitse, ma arvan.
- Kell 7. Väga kurb! Väga kurb!
Keiser tänas ja kummardus. Prints Andrei tuli välja ja teda ümbritsesid kohe igast küljest õukondlased. Õrnad silmad vaatasid teda igalt poolt ja kuulsid head sõnad. Eilne adjutant heitis talle ette, et ta ei jäänud paleesse ja pakkus talle oma kodu. Sõjaminister astus ligi, õnnitledes teda keisri poolt annetatud Maria Theresia III klassi ordeni puhul. Keisrinna kojahärra kutsus ta Tema Majesteedi juurde. Ka ertshertsoginna tahtis teda näha. Ta ei teadnud, kellele vastata, ja võttis paar sekundit oma mõtete kogumiseks. Vene saadik võttis tal õlast kinni, viis akna juurde ja hakkas temaga rääkima.
Vastupidiselt Bilibini sõnadele võeti tema toodud uudised rõõmsalt vastu. Kavas oli tänujumalateenistus. Kutuzovile autasustas Maria Theresia suurrist ja kogu armee sai ordenid. Bolkonsky sai kutseid igalt poolt ja pidi kogu hommiku Austria peamiste aukandjate juurde visiidid tegema. Olles oma visiidid kell viis õhtul lõpetanud, kirjutades mõttes isale kirja lahingust ja reisist Brunni, naasis prints Andrei koju Bilibini. Bilibini elatud maja verandal seisis poolikuks asjadega täidetud britzka ja uksest väljus Bilibini sulane Franz, kes vedas vaevaliselt kohvrit.